6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
|
貨號
|
名稱
|
規格
|
|
RTD6162
|
6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
|
10次
|
● 產品組成：
|
貨號
|
名稱
|
規格
|
貯存
|
|
RTD6162-UA
|
上層膠溶液A
|
15
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-UB
|
彩色上層膠溶液B
|
15
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-LA06
|
下層膠溶液A 6%
|
30
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-LB
|
下層膠溶液B
|
30
ml
|
4℃
|
|
TA1510
|
400×抗氧化劑
|
15
ml
|
4℃
(配制后-20℃貯存)
|
|
TA050
|
10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(變性電泳,溶液型）
|
500
ml
|
RT
|
|
PL080-01
|
5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性，還原)
|
1 ml
|
-20℃
|
|
RTD6202-02
|
FastBlue蛋白快速染色液
|
500 ml
|
RT
|
|
TA5030P
|
10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）
|
500
ml
|
RT
|
|
AP020P
|
10%
APS（干粉）
|
5
ml
|
RT
(配制后-20℃貯存)
|
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5
ml
|
4℃ 避光
|
|
|
說明書
|
一份
|
-
|
● 產品簡介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電泳適合于分離高分子量蛋白，可以有效分離50-500 kD范圍內蛋白；電泳體系呈中性，能有效提高蛋白的穩定性；電泳緩沖體系中加入抗氧化劑，整個電泳過程都在還原條件下進行，有效防止二硫鍵的形成。
該試劑盒包含凝膠制備、蛋白上樣、蛋白電泳、蛋白染色及轉膜所需的全部試劑。試劑盒配套的制膠溶液，可以配制10板厚度1mm凝膠（面積8×10 cm），分離膠濃度為6%，可以有效分離50-500 kD范圍內蛋白。配好的凝膠濃縮膠為紅色，方便上樣。本試劑盒用于蛋白變性還原電泳，不適用于蛋白非變性電泳。
按照一次實驗電泳一板凝膠計算，本試劑盒可以使用10次。
● 貯存、運輸及效期：
按照標簽溫度貯存；試劑盒常溫運輸；有效期一年。
● 使用說明：
一. 實驗準備：
1.1 10%APS為干粉，用前加入5 ml超純水震蕩徹底溶解，適量分裝后取一管使用。溶解后的APS -20℃貯存。
1.2 400×抗氧化劑為干粉，用前加入15 ml超純水震蕩徹底溶解后使用，已經溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。
二. 凝膠配制：
2.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
2.2 根據下表配制凝膠：
|
下層膠配方
|
上層膠配方
|
|
膠厚度
|
下層膠溶液B
|
下層膠溶液A
|
10%APS
|
TEMED
|
膠厚度
|
彩色上層膠溶液B
|
上層膠溶液A
|
10%APS
|
TEMED
|
|
0.75 mm
|
2 ml
|
2 ml
|
40 μl
|
4 μl
|
0.75 mm
|
0.5 ml
|
0.5 ml
|
10 μl
|
1 μl
|
|
1.0 mm
|
2.5 ml
|
2.5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
1.0 mm
|
0.75 ml
|
0.75 ml
|
15 μl
|
1.5 μl
|
|
1.5 mm
|
4 ml
|
4 ml
|
80 μl
|
8 μl
|
1.5 mm
|
1 ml
|
1 ml
|
20 μl
|
2 μl
|
2.2.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ，各
2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的10%APS和4/5/8
μl的TEMED，輕輕混勻，將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可；
注意：此溶液為過量，請勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無水乙醇覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固后，倒去上層水或乙醇；
注意：當水（乙醇）和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固；25℃時10-15分鐘可以聚合。
2.2.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各
0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的10%APS和1/1.5/2
μl 的TEMED，輕輕混勻，插入梳齒；
2.2.6 待上層膠凝固后 （約20-40
min），拔去梳齒即可用于電泳。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
三. 電泳：
3.1 準備1×電泳緩沖液：
|
總體積
|
1000
ml
|
|
10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液
|
100 ml
|
|
超純水
|
900 ml
|
3.1.1 外槽緩沖液：取適量體積1×電泳緩沖液用于外槽緩沖液。
3.1.2 內槽緩沖液：200 ml 1×電泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合均勻后用于內槽緩沖液。
3.2準備上樣樣品：
注：表格以配制10 μl樣品為例，其他體積按照比例調整。
|
|
總體積10 μl
|
|
組份
|
還原樣品
|
|
蛋白樣品
|
x μl
|
|
5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性，還原)
|
2 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
95℃ 10分鐘
|
3.3電泳過程；
在電泳槽的內槽加入內槽緩沖液（已加入抗氧化劑），讓電泳緩沖液漫過加樣孔，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；隨后在電泳槽外槽加入適量的外槽緩沖液（不用添加抗氧化劑）。上樣，電泳。
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
|
200
V
|
65-75 mA/板膠
|
35-55 mA/板膠
|
50+min
|
|
注：冰浴電泳（可選）
|
四. 染色：
注：如果只是觀察蛋白的分離情況，對凝膠進行染色。如果要后續進行WB實驗，凝膠不要染色，進行步驟五。
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），搖床常溫搖動，條帶5-10分鐘即可見（蛋白含量高于1
μg條帶）。
4.2 搖床常溫繼續搖動15-30分鐘至條帶清晰可見。
4.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4.4 觀察保存結果。
五. 轉膜：
5.1 轉印膜選擇：
Tris-醋酸凝膠轉膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。
5.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型）配制：
將10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）粉末溶解于500 ml超純水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型），不要調節pH，pH~7.2。
5.3 準備1×轉膜緩沖液：
|
|
|
1×即用型轉膜緩沖液 配制量 1升
|
|
|
10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)
|
100
ml
|
|
20-80 kD蛋白
|
無水甲醇
|
10%
|
|
SDS
|
0.05%
|
|
＞80 kD蛋白
|
無水甲醇
|
10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
|
|
SDS
|
0.1%
|
|
|
超純水
|
定容至1升，不要調節pH，pH~7.2
|
注：甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加結合在膜上，而SDS讓蛋白更加離開膜。因此對大蛋白轉膜來說，多加SDS，少加甲醇；而對小蛋白轉膜，多加甲醇，少加SDS。
5.4 轉膜條件：
高分子量蛋白建議濕轉。以下轉膜條件僅供參考，客戶針對自己的目的蛋白，最好經過1-2次預實驗后，確定最佳的轉膜條件。
|
膜孔徑
|
蛋白大小
|
穩流
|
建議時間
|
降溫措施
|
|
0.45 μm
|
50-200 kD
|
350 mA
|
~60分鐘
|
需要
|
|
0.45 μm
|
高于200
kD
|
350 mA
|
~2-3小時
|
需要
|
六. 實驗示例：
凝膠：6%Tris醋酸手灌膠
電泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；內槽加抗氧化劑
染色：FastBlue蛋白染色液染色 15 分鐘
樣品：4K-BME-細菌裂解物；K562-懸浮細胞RIPA提取總蛋白