Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
|
貨號
|
名稱
|
規格
|
|
WS1080-100ml
|
Western一抗二抗去除液（弱堿性，劇烈型）
|
100 ml
|
● 產品組成：
|
貨號
|
名稱
|
規格
|
貯存
|
|
WS1080-01
|
Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
|
100 ml
|
RT
|
|
WS1080-02
|
增強劑
|
1 ml
|
4℃（配成溶液后-20℃貯存）
|
|
|
說明書
|
一份
|
|
● 產品簡介：
Western抗體去除液（中性，劇烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，neutral，harsh type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影響，用于Western中轉移了蛋白的膜的重復利用，可以轉一次膜，做多次Western印跡實驗，通常可以重復利用膜2-3次。使用本試劑只需大約20-30分鐘即可實現蛋白膜的重復使用，然后可以進行Western的后續操作。以每次使用5 ml Western抗體清除液計算，本產品可以使用20次。
該產品具有以下幾個優點：
1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；
2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；
3.有利于對異常結果進行重新分析或確認；
4.有利于糾正孵錯的抗體；
5.節約試劑成本，并節約時間。
各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。
● 貯存：
按照標簽溫度貯存，有效期一年；常溫運輸。
● 用前必讀：
1. 理想的抗體去除液應該是洗脫抗體的同時，不洗脫膜上結合的蛋白或者不改變抗原的結合性質，但是目前沒有一種去除液可以做到只洗脫抗體，而完全不洗脫膜上結合的抗原；也沒有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復合物。去除液洗脫能力太強，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高。因此，從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途，因為在每個抗體清除循環中，或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。
2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實驗。
3. 從SDS-PAGE凝膠轉印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質與膜的結合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實驗。在第一輪抗體檢測之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪ECL發光檢測實驗后，需要用清除液清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。
4. 檢測時，優先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達較低）的蛋白，再孵育條帶明顯（表達較高）的蛋白，最后再孵育內參。
5. 如條件允許，下一輪的抗體雜交實驗選擇種屬來源不同的一抗（對應不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應。
6. 該清除液適用于ECL發光檢測的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒光檢測。
● 使用說明：
1. 在完成Western化學發光檢測后，NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復漂洗2次；1×TBST漂洗一次。
2. 棄1×TBST，加入適量的Western一抗二抗去除液和1/100體積的增強劑（例如使用5 ml去除液，加50 μl 增強劑）；在搖床上震蕩漂洗20-30分鐘（轉速70 -80
rpm）。
|
操作溫度
|
震蕩清除時間
|
備注
|
|
18℃
|
40-60分鐘
|
冬天實驗室氣溫低時
|
|
25℃
|
約30分鐘
|
常規樣品操作
|
|
50℃
|
15-20分鐘
|
膜上蛋白含量高的樣品或清除與膜親和力高的抗體
|
3. 棄去除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分鐘，把去除液徹底漂洗干凈。
注：殘余的去除液會影響后續抗原抗體的的結合。
4. 可選步驟：漂洗后的轉印膜孵育ECL發光液，檢測二抗的清除效率。曝光5分鐘，膜上看不到發光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶，重復步驟2-3。
5．繼續進行Western的后續操作（封閉-抗體孵育-發光檢測）。
注：建議每次膜剝離后都要進行重新封閉，以降低背景。
● 實驗示例：
Western一抗二抗去除液檢測效果圖
樣品：293細胞，Ball-1細胞總蛋白(TP)，胞漿蛋白(C-Pr)，核蛋白(N-Pr)
電泳條件：12% SDS-PAGE（貨號:RTD6132） 200
V 1×TGS 53 min
轉膜條件：NC膜，1×RealBlot
恒流400 mA 35 min
封閉：無蛋白快速封閉液
RT 60 min
一抗：TBP鼠單抗
1:5000 RT 60min孵育(圖一)
GAPDH兔多抗
1:2000 RT 60 min孵育(圖三)
二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min(圖一)
羊抗兔IgG-HRP
1:5000 RT 60 min (圖三)
抗體去除：NC膜蒸餾水漂洗3次，加入5 ml抗體去除液和50 μl
增強劑，常溫，搖床 30 min
ECL曝光5分鐘（圖二），ECL曝光2秒（圖一，圖三）