RealPAGE®彩色PAGE凝膠快速制備試劑盒（兩步法）
RealPAGE® Two-Step Colour PAGE
Gel Fast Preparation Kit
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貨 號
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名 稱
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可制膠數(shù)量
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RTD6133-Y
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制備6%PAGE膠，黃色上層膠
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125塊 0.75 mm膠
＞90塊1.0 mm膠
＞60塊1.5 mm膠
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RTD6133-G
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制備7.5%PAGE膠，綠色上層膠
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RTD6133-B
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制備10%PAGE膠，藍色上層膠
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RTD6133-R
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制備12.5%PAGE膠，紅色上層膠
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RTD6133-V
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制備15%PAGE膠，紫色上層膠
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● 貨品內(nèi)容：
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組份
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名稱
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規(guī)格
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1
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上層膠溶液（2×）
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80 ml
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2
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上層膠緩沖液（2×）
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80 ml
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3
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下層膠溶液（2×）
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250 ml
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4
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下層膠緩沖液（2×）
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250 ml
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5
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改良型促凝劑
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10 ml
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6
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刻度配膠杯
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6個
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7
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說明書
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一份
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● 運輸、貯存及效期：
本產(chǎn)品常溫運輸；4-8℃貯存，其中配制后的改良型促凝劑貯存于-20℃；有效期一年。
● 產(chǎn)品特點：
快速制備凝膠：短時間即可灌制多塊凝膠，無需計算所需溶液量，無需稀釋；
彩色上層膠：可制備五種顏色的上層膠，為點樣和區(qū)分不同凝膠提供便利；
避免異味：無需使用 TEMED，環(huán)境安全友好；
凝膠高穩(wěn)定性：中性pH凝膠,有效提高凝膠穩(wěn)定性,密封條件下，凝膠可以四度貯存6個月。
兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）。
● 產(chǎn)品簡介：
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用上層膠和下層膠的預(yù)混配方，只需加入改良型促凝劑，可在15-30分鐘內(nèi)配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠，可用于變性和非變性蛋白凝膠電泳，適用于Tris-甘氨酸電泳體系（Laemmli體系）。本產(chǎn)品可以配制6%（黃色上層膠）、7.5%（綠色上層膠）、10%（藍色上層膠）、12.5%（紅色上層膠）和15%（紫色上層膠）的分離膠濃度，所配的上層膠帶有顏色 (黃色、綠色、藍色、紅色或紫色 )，點樣孔清晰易辨，方便點樣，可以滿足絕大多數(shù)蛋白電泳需求。
本產(chǎn)品配套提供改良型促凝劑 ，其具有更好的穩(wěn)定性和催化效能，配膠過程中無需額外添加TEMED。為方便操作，已開蓋使用中的改良型促凝劑，可置于 4℃保存至少三個月，-20℃保存一年。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規(guī)大小（8×10 cm）的PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75 mm厚度凝膠可以配制125塊膠，1.0 mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠，1.5 mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 使用說明：
一. 制膠前的準(zhǔn)備：
1.1 即用型改良型促凝劑配制：
試劑盒提供的改良型促凝劑為干粉，第一次使用前加入10 ml超純水，徹底溶解后使用。配制好的即用型改良型促凝劑置于4℃?zhèn)溆茫L期不用建議-20℃貯存。
1.2
推薦操作：
實驗前半小時，取出試劑盒所有組份，常溫靜置半小時使溶液恢復(fù)到常溫后輕柔混勻，可以有效降低制膠時產(chǎn)生氣泡的可能性。
二. 凝膠配制(以一塊0.75/1.0/1.5 mm厚度的8×10 cm膠為例)：
2.1 下層膠制備：
2.1.1 根據(jù)表一配制下層膠：
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表一 下層膠配方
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膠厚度
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下層膠溶液
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下層膠緩沖液
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促凝劑
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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2.1.2 取等體積下層膠溶液和下層膠緩沖液，混勻；
2.1.3混合溶液中加入改良型促凝劑，輕輕混勻；
注： 加入改良型促凝劑后，需輕柔混勻，防止過多氧氣混入膠溶液，抑制凝膠聚合和導(dǎo)致凝膠內(nèi)可能產(chǎn)生氣泡。
2.1.4
將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離為約1.5
cm或距離梳齒下沿距離為約0.5
cm即可；
注：此溶液為過量，請勿全部注入；可留少許于制膠杯中， 便于判斷凝膠狀態(tài)。
2.1.5 封閉：沿玻璃板緩慢加入適量超純水或醇（無水乙醇或異丙醇）覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固后（5-15 min），倒去上層水或醇，可用濾紙將殘余溶液吸盡；
注：當(dāng)水（醇）和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固；凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。下層膠25℃ ~8分鐘可以聚合；18℃ ~15分鐘可以聚合。
2.2 上層膠配制(以一塊0.75/1.0/1.5 mm厚度的8×10cm膠為例)：
2.2.1 根據(jù)表二配制上層膠：
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表二 彩色上層膠配方
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膠厚度
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上層膠溶液
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彩色上層膠緩沖液
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促凝劑
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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2.2.2 取等體積上層膠溶液和彩色上層膠緩沖液，混勻；
注：由于染料的特殊理化性質(zhì)，使用前請搖勻彩色上層膠緩沖液。
2.2.3向混合溶液中加入改良型促凝劑，輕輕混勻；
注： 加入改良型促凝劑后，需輕柔混勻，防止過多氧氣混入膠溶液，抑制凝膠聚合和導(dǎo)致凝膠內(nèi)可能產(chǎn)生氣泡。
2.2.4將混合溶液注入制膠玻璃板中，插入梳齒，待上層膠凝固后 （約15-40 min），拔去梳齒即可用于電泳。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。上層膠25℃ ~15分鐘可以聚合；18℃ ~25分鐘可以聚合。
附：溫度與凝膠時間參考表
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環(huán)境溫度
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18℃
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25℃
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37℃
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凝固時間
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上層膠
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~25 min
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~15 min
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~10 min
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下層膠
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~15 min
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~8 min
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~5 min
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三. 電泳：
3.1 變性電泳：
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電泳緩沖液
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Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液
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上樣緩沖液
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5×蛋白上樣緩沖液（變性，還原）
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電泳條件
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恒壓 200V 40-55 min
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3.2 非變性電泳：
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電泳緩沖液
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Tris-甘氨酸電泳緩沖液
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上樣緩沖液
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5×蛋白上樣緩沖液（非變性，非還原）
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電泳條件
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恒壓150V 50-65 min
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非變性電泳必看：該凝膠體系pH大約8左右，適用于等電點pI小于8的蛋白電泳分離，pI越遠離8，帶的負電荷越多，分離就更容易；等電點接近8或者高于8的蛋白不適合用該系統(tǒng)進行非變性電泳。
四. 凝膠染色或轉(zhuǎn)膜：
4.1 凝膠染色可以選擇FastBlue蛋白快速染色液(貨號：RTD6202)， 可以在30分鐘內(nèi)完成染色和脫色，也可以選擇常規(guī)法考馬斯亮藍蛋白染色液（貨號：RTD6203）。
4.2 轉(zhuǎn)膜緩沖液可以使用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜。濕轉(zhuǎn)法可以使用經(jīng)典Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：TB1040）或者使用10×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液（貨號：RT5020）。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜可以使用5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：RT5030）。
五. 凝膠濃度選擇參考：
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目的蛋白分子量
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下層膠濃度
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壓縮前沿
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10 kD以下
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15%
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~6 kD
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10-45 kD
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12.5%
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~10 kD
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45-100 kD
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10%
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~15 kD
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100-180 kD
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10%/7.5%
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~15 kD/~25 kD
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180-250 kD
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7.5%
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~25 kD
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250 kD以上
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6%
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~60 kD
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上圖為 Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)中，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (10-180
kDa，含有 10 條蛋白條帶 ) 在不同濃度的 SDS-PAGE凝膠中的分離示意圖。因溫度、pH 值等因素不同，實際分離情況會略有出入，本圖僅供參考。
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